Organites, ubiquitinylation et signalisation

projet 2

Caractérisation de DUBs impliquées dans la régulation négative de la signalisation après reconnaissance des ARNs viraux

     Tout comme la phosphorylation, l'ubiquitination est un phénomène réversible par l'intermédiaire des dé-ubiquitinases (DUBs) qui sont des protéases. Il existe une centaine de DUBs dans le génome humain mais peu ont été caractérisées pour le moment. Dans le cas d'ubiquitination K63, dont le rôle est la transduction du signal grâce au recrutement de complexes kinasiques comme le complexe IKK, la fonction de certaines DUBs va être d'inhiber la transduction du signal en clivant ces chaines d'ubiquitines.

     Nous disposons au laboratoire d'une banque de siRNAs dirigée contre les différentes DUBs (à nouveau 2 siRNAs par cible) et nous avons utilisé cette banque pour réaliser un criblage en essais luciférase de cellules HEK293T exprimant de façon stable le Toll-like Recepteur 3 (TLR3) et traitées au poly(I :C), un analogue des ARNs double brins viraux qui sont les ligands du TLR3. La stimulation du TLR3 conduit non seulement à la production de cytokines pro-inflammatoires via l'activation de NF-κB mais également à la production d'IFN de type I via le facteur de transcription IRF3 (Figure 2).

Figure 2. La signalisation du TLR3 et l'implication de l'ubiquitination K63

     Le TLR3 présent dans les endosomes se lie à son ligand, l'ARN double brin. L'adaptateur TRIF se fixe au domaine cytoplasmique du TLR3 ce qui permet alors le recrutement de TRAF6, RIP1 et TRAF3. L'ubiquitination K63 de TRAF6 et RIP1 permet aux complexes TABs/TAK1 et IKK d'être recrutés, ce dernier étant activé par la phosphorylation d'IKKβ par TAK1. L'ubiquitination K63 de TRAF3 quant à elle permet le recrutement d'un autre complexe comprenant notamment NEMO et la kinase TBK1 laquelle phosphoryle IRF3 ce qui conduit à son activation et dimérisation pour produire les IFNs de type I.

     L'activation de NF-κB ou d'IRF3 peut être mesurée par essais luciférase si bien que ces essais sont utilisés pour identifier d'éventuelles DUBs régulant négativement les voies qui conduisent à l'activation de NF-κB et/ou d'IRF3. De fait, nous nous intéressons aux protéines dont l'extinction à l'aide des siRNAs augmente l'activité NF-κB ou bien celle du promoteur IFNβ. Il existe déjà trois DUBs connus comme régulant négativement la voie NF-κB, il s'agit d'A20, CYLD et Cezanne alors que DUBA pourrait réguler négativement la voie IRF3 même si cela n'a jamais été confirmé par un modèle animal. De fait, nous nous focalisons principalement dans notre crible sur les DUBs qui apparaissent comme régulant négativement la voie IRF3. Nous avons quelques protéines candidates et nous sommes en train d'étudier leur implication dans la régulation de la signalisation du TLR3 ainsi que dans la voie des RIG-I-like Récepteurs (RLR).

     La caractérisation d'une telle DUB serait d'une grande importance dans le domaine de l'immunité innée car l'élaboration d'inhibiteurs de cette protéase pourrait avoir un grand intérêt en vue de nouvelles thérapies anti-virales.

Projet 3

Implication de l'Appareil de Golgi et de l'ubiquitination dans le trafic et l'activation de TBK1

     Outre son auto-phosphorylation, de récents travaux ont démontré l'importance de la polyubiquitination de la kinase TBK1 pour permettre son activation afin d'induire la production d'IFN de type I. Nos récents résultats montrant l'implication du RE comme plateforme d'accumulation des TUCAN, nous a alors conduit à examiner si on observait également une accumulation de la forme ubiquitinylée de TBK1 au niveau des membranes lourdes après activation des RLRs ou du TLR3. Ainsi, de manière surprenante, nous avons observé, après lyse mécanique des cellules et centrifugations différentielles, une accumulation de TBK1 polyubiquitinylée et phosphorylée au niveau de la fraction membranaire enrichie en Appareil de Golgi après activation des RLRs en infectant des MEFs par le virus de Sendai. Nous avons fait les mêmes observations après infection de cellules HeLa mais également et c'est intéressant de le signaler, après activation du TLR3.

     Une analyse en immunofluorescence montre que bien que la localisation TBK1 n'est pas modifiée après activation des RLRs, la forme active (p-TBK1) semble s'accumuler au niveau de l'Appareil de Golgi et non aux mitochondries.

     En conditions physiologiques, lors de l'infection par le virus de Sendai, la localisation de TBK1 ne semble pas être affectée. Nous nous sommes demandés ce qu'il en était alors suite à une activation exacerbée des RLRs, par exemple après transfection de poly (I:C). En effet, dans le cytosol, le poly (I:C) est reconnu soit par MDA-5 ou RIG-I selon son poids moléculaire. De façon intéressante, la transfection de poly (I :C) conduit alors à une agrégation de TBK1 associée à la translocation nucléaire d'IRF3 et cette agrégation de TBK1 se fait au niveau de l'Appareil de Golgi, où l'on retrouve effectivement la forme active de TBK1. Même si il s'agit d'un modèle non physiologique où la stimulation des RLRs est exacerbée, il semble qu'après la stimulation des RLRs (mais également du TLR3), TBK1 se relocalise au niveau de l'Appareil de Golgi où va alors se produire l'activation de TBK1.

     Une étude très récente a montré un rôle essentiel de l'ubiquitination des lysines 30 et 401 de TBK1 pour une activation efficace de cette kinase. Comme nous observons une accumulation de TBK1 ubiquitinylée et phosphorylée au niveau de l'Appareil de Golgi, nous pensons alors que l'ubiquitination de TBK1 permet son adressage au Golgi où elle peut alors s'activer par trans-autophosphorylation. Pour vérifier cela, nous allons très bientôt reconstituer des MEFs TBK1 -/- que l'on a obtenu du laboratoire du Dr. K. Fitzgerald (University of Massachusetts Medical School, Worcester, USA) avec le mutant TBK1K30-401A ainsi qu'avec TBK1 WT comme control. Après transfection du poly (I :C), nous regarderons alors si la relocalisation de TBK1 au Golgi est inhibée dans les MEFs TBK1 -/- reconstitués avec le mutant de TBK1, par rapport aux cellules exprimant le TBK1 WT. Cette expérience confirmerait alors le rôle de l'ubiquitination de TBK1 dans le trafic de TBK1 au cours de son activation.

     Une autre étude très récente a proposé que les chaines d'ubiquitines associées à TBK1 étaient reconnu par des « senseurs » afin de permettre le rapprochement des molécules de TBK1 pour la trans-autophosphorylation. Un tel senseur se doit par conséquent d'avoir des UBD (Ubiquitin Binding Domains) et selon nos observations, devrait être également localisé au niveau de l'Appareil de Golgi. Nous sommes alors à la recherche d'un tel senseur et nous orientons nos recherches sur l'optineurine qui semble être un bon candidat (Figure 3).

Figure 3. Proposition de modèle impliquant l'Appareil de Golgi dans l'activation de TBK1.

L'ubiquitination de TRAF3 après stimulation des RLRs ou du TLR3 permet le recrutement du complexe comprenant NEMO/TBK1, laquelle est également ubiquitinylée et les chaines d'ubiquitine liées à cette kinase sont alors reconnu par un senseur comme l'Optineurine (OPTN) localisée à l'appareil de Golgi pour une activation optimale de TBK1. Après trans-autophosphorylation, TBK1 phosphoryle IRF3 afin de permettre la production d'IFNs de type I.